- Reinkulturgewinnung -

Versuchsziel:

In diesem Versuch soll verschiedene Techniken des Verdünnungsausstriches (13-Strich- und 3-Ösenausstrich-Verfahren) zum Zwecke der Gewinnung von mikrobiellen Reinkulturen angewandt und erprobt werden.

Theoretische Grundlagen:

Um eingehendere Untersuchungen an Mikroorganismen machen zu können, ist es meist notwendig, dass der zu untersuchende Organismus in Reinkultur vorliegt, um Experimente und daraus gewonnene Ergebnisse eindeutig einem Organismus zuordnen zu können. Unter einer Reinkultur versteht man eine homogene Kultur von gleichartigen Organismen einer einzigen Art, die frei ist von Mikroorganismen anderer Art (sog. Kontaminanten). Idealerweise sollte eine solche Kultur nur aus einer einzigen Zelle hervorgegangen sein, so dass man einen Klon erhält, dessen Einzelorganismen genetisch untereinander (nahezu) identisch sind. Da ein Verfahren zur Isolierung und Vermehrung einer einzigen Zelle in der Praxis meist zu aufwendig ist, versucht man durch Verdünnung und Ausplattierung von Zellsuspensionen annähernde Ergebnisse zu erzielen. Bei solchen Ausplattierungen kommt es zur Bildung von Kolonien, von denen, wenn sie isoliert gewachsen sind, man behaupten kann, dass sie aus einer einzelnen Zelle oder zumindest aus einem Zellverband hervorgegangen sind. Zweckmässiger Weise spricht man in diesem Fall von Kolonie bildenden Einheiten, abgekürzt KbE. Solche Kolonien, die ja Populationen gleichartiger Organismen einer Art darstellen, lassen sich dann durch weiteres Überimpfen und Ausplattieren weiter vermehren und aufreinigen, z.B. um vorhandene Kontaminanten zu eliminieren. Um überhaupt eine Mikroorganismenart aus einer Mischpopulation zu gewinnen, muss man die zu isolierende Art meist anreichern (s. Versuch F) und dann aus der angereicherten Population versuchen, den gewünschten Mikroorganismus zu isolieren. Dazu bedient man sich selektiver Nährmedien, die dem zu isolierenden Organismus optimale Wachstumsbedingungen bieten, während sie andere, evt. konkurrierende Arten, benachteiligen. Bei der nachfolgenden Vereinzelung benutzt man jedoch meist Universalnährmedien, um evt. Kontaminanten festzustellen. Zum Zwecke des Vereinzelung werden verschiedene Verfahren angewandt, i.d.R. handelt es sich hierbei um Plattenverfahren, d.h. um Verfahren, bei denen die zu behandelnde Kultur auf bzw. in einer Agarplatte ausgebracht wird. Gängige Plattenverfahren sind das Guss- und das Spatelplattenverfahren (s.a. Versuch E2) und Verfahren des Verdünnungsausstriches. Es existieren verschiedene Varianten des Verdünnungsaustrichs, von denen das 13-Strich-Verfahren und der 3-Ösenausstrich in diesem Versuch angewendet und nachfolgend kurz beschrieben werden. ^[1]

13-Strich-Verfahren:
Bei dem 13-Strich-Verfahren wird zunächst die Impföse ausgeglüht und diese auf dem Rand der zu beimpfenden Agarplatte abgekühlt. Nun wird mit der Impföse ein Inokulum von der auszustreichenden Probe, i.d.R. eine Zelllsupension, entnommen und dann die Impföse am Rand der Platte leicht aufgesetzt und ein erster Strich ausgezogen. Parallel dazu werden zwei weitere Striche ausgezogen, ohne dass diese sich untereinander berühren. Nun wird die Impföse abermals ausgeglüht und abgekühlt. Eine solche Vorgehensweise, bei der die Impföse nach jeder Ausstrichserie ausgeglüht wird, soll den Erfolg der Vereinzelung beträchtlich erhöhen und wird auch als fraktionierter Verdünnungsausstrich bezeichnet. Nun werden am Ende der ersten Ausstrichserie um ca. 90° versetzt drei weitere parallele Ausstriche aufgebracht, derart, dass der erste Strich der zweiten Ausstrichserie alle drei Ausstriche der ersten Serie überstreicht, der zweite die letzten beiden der ersten Ausstrichserie und der dritte bzw. insgesamt sechste Strich nur den dritten bzw. letzen Strich der ersten Ausstrichserie. Den Versatz um ca. 90° erreicht man am zweckmässigsten dadurch, dass man die Petrischale in Richtung des gewünschten Ausstrichs dreht. Nun wird die Impföse abermals ausgeglüht, abgekühlt, die Petrischale wiederum um 90° gedreht und nach gleichem Schema eine dritte Austrichserie, ausgehend von der zweiten Serie, aufgetragen. Dann wird die Impföse wieder ausgeglüht, abgekühlt, die Petrischale abermals um 90° gedreht und eine vierte Ausstrichserie aufgebracht, mit dem Unterschied zu den vorhergehenden, dass zum Schluss ein vierter, der insgesamt 13., Austrich aufgebracht wird, der keinen der vorhergehenden Ausstriche berührt. Nachfolgende Skizze soll das Ausstrich-Verfahren nochmals veranschaulichen:

3-Ösenausstrich-Verfahren:
Auch hier wird die Impföse ausgeglüht und am Rand der zu beimpfenden Platte abgekühlt, bevor damit ein Inokulum aus der zu verdünnenden Probe aufgenommen wird. Die Impföse mit dem Inokulum wird leicht auf den Agar aufgesetzt und dann von Rand zu Rand, allerdings ohne diesen zu berühren, in einer "Zick-Zack-Bewegung" bis etwa zu einem Drittel bis zur Hälfte der Platte ausgestrichen. Die Impföse wird erneut ausgeglüht, abgekühlt, die Petrischale um ca. 90° gedreht und dann der Ausstrich so angesetzt, dass hinter dem ersten Ausstrich aufgesetzt wird, Material von diesem aufgenommen wird, indem dieser überstrichen wird, und dieses Material weiter auf der Platte durch erneute "Zick-Zack-Bewegung" verteilt wird. Die Impföse wird erneut ausgeglüht, abgekühlt, die Petrischale um ca. 90° gedreht und ein dritter Ausstrich, analog dem Vorgehen des zweiten Ausstrichs, aufgebracht. Nachfolgende Skizze soll die Technik des 3-Ösenaustrichs noch einmal veranschaulichen:

Versuchsdurchführung:

1. Woche
In diesem Versuch wurden aus einer Mischkultur von Bacillus subtilis, Pseudomonas fluorescens und Rhodotorula glutinis mit zwei verschiedenen Ausstrichverfahren, dem 13-Strich-Verfahren und dem Dreiösenausstrich-Verfahren, auf drei verschiedenen Nährböden (HPG-, KB- und YGC-Agar), fraktionierte Ausstriche vorgenommen. Dazu wurden zunächst die schon fertig gegossenen und gebrauchsfertigen Agarplatten auf der Unterseite der Petrischalen beschriftet.
Die Nährmedien hatten folgende Zusammensetzung:

HPG-Agar
zu 1000 ml Aqua demin. wurden zugesetzt:

• 5,0 g  Hefeextrakt
• 5,0 g  Pepton aus Fleisch
• 0,25 g Glucose
• 15 g  Agar

Der pH-wert wurde auf 7,2 eingestellt.

YGC-Agar
zu 1000 ml Aqua demin. wurden zugesetzt:

• 5,0 g Hefeextrakt
• 20,0 g D(+)-Glucose
• 0,1 g Chloramphenicol
• 14,9 g Agar

Der pH-Wert wurde auf 6,6 eingestellt.

King B-Agar (KB)
zu 1000 ml Aqua demin. wurden zugesetzt:

• 20,0 g Protease-Pepton
• 10,0 g Glycerin (reinst)
• 1,5 g Magnesiumsulfat (MgSO₄)
• 1,8 g Tri-Kaliumphosphat-3-hydrat (K₃PO₄ × H₂)
• 15,0 g Agar

Der pH-Wert wurde auf 7,1 eingestellt.

Von jedem der aufgeführten Agarplatten wurde je eine im 13-Strich-Verfahren und eine im Dreiösenausstrich-Verfahren beimpft, so dass 6 Agarplatten erhalten wurden. Dazu wurde die bereitgestellte Zellsuspension mit der Mischkultur von Bacillus subtilis, Pseudomonas fluorescens und Rhodotorula glutinis gut mit dem Reagenzglasmischgerät durchmischt, dann die ausgeglühte Impföse am Rande der KB-Agarplatte abgekühlt und ein Inokulum aus der Suspension aufgenommen und dieses auf der Agarplatte im 13-Strich-Verfahren aufgebracht. Ebenso wurde der HPG-Agar und der YGC-Agar mit einem Inokulum aus der Mischkultur im 13-Strich-Vefahren beimpft. Nun erfolgte der Ausstrich der Mischkultur im 3-Ösen-Ausstrich-Verfahren, wobei nacheinander der KB-, YGC- und HPG-Agar mit der Impföse beimpft wurde. Nun wurden die beimpften Agarplatten mit der Unterseite nach oben inkubiert: Die HPG-Platten für 2 Tage bei 25 °C, die YGC-Platten bei 25 °C für ca. 5 Tage und die KB-Platten bei 25 °C für 3 Tage.

2. Woche
In der zweiten Woche erfolgte die Ausstrichkontrolle. Dazu wurde jede Platte auf eine dunkle Unterlage (Labortisch) gelegt und daraufhin untersucht, ob Koloniebildung erfolgt war und wenn ja, ob die enstandenen Kolonien auf den Linien des Ausstrichschemas lagen. Ferner wurde überprüft, ob die Vereinzelung von Kolonien sichtbar war, d.h. ob einzelne Kolonien isoliert gewachsen waren und ob eine Kontamination mit anderen Keimen stattgefunden hatte (z.B.mit Luftkeimen), d.h. ob die sterile Arbeitsweise erfolgreich gewesen war. Ferner wurden die enstandenen Kolonien makroskopisch charakterisiert.
Dann wurden von isoliert liegenden, gut gewachsenen Kolonien Zellsuspensionen von je Bacillus subtilis, Pseudomonas fluorescens und Rhodotorula glutinis mit sterilem Wasser angefertigt. Dazu wurde von drei Reagenzgläsern mit sterilem Wasser der Inhalt über dem Waschbecken ausgekippt, so dass noch ein kleiner Rest in den Reagenzgläsern verblieb. Dann wurde die Impföse ausgeglüht, eines der Reagenzgläser in die andere Hand genommen und der Deckel einer der YGC-Platten mit guter Vereinzelung von Rhodotorula glutinis leicht angehoben, die Impföse am Rand der Agarplatte abgekühlt und etwas Zellmaterial von einer isoliert liegenden Rhodotorula glutinis Kolonie aufgenommen, die Petrischale wieder geschlossen, der Wattestopfen des Reagenzglases abgezogen und die Impföse vorsichtig, ohne die Wände des Reagenzglases zu berühren, zum Boden des schräg gehaltenen Reagenzglases eingeführt und das Inokulum durch leichtes hin- und herbewegen in dem verbliebenen Wassertropfen suspendiert. Das Reagenzglas wurde wieder verschlossen und beschriftet, die Impföse im Innenkegel der Bunsenbrennerflamme getrocknet und hernach ausgeglüht. Nach der gleichen Vorgehensweise wurde von der KB-Platte ein Inokulum von Pseudomonas fluorescens und von der HPG-Platte ein Inokulum von Bacillus subtilis in den verbleibenden Reagenzgläsern suspendiert. Diese Suspensionen wurden benutzt, um weitere Ausstrichserien anzufertigen. Dazu wurden von jeweils einer der Zellsuspension mit der Impföse ein Inokulum entnommen und auf einer bereitgestellten frischen HPG-Agarplatte im 13-Strich-Verfahren ausgestrichen, so dass je ein beimpfter HPG-Agar mit Bacillus subtilis, Pseudomonas fluorescens und Rhodotorula glutinis erhalten wurde. Die Agarplatten wurden nun mit der Unterseite nach oben inkubiert: Der Ausstrich von Bacillus subtilis für 2 Tage bei 25 °C, der von Pseudomonas fluorescens für 3 Tage bei 25 °C und derjenige von Rhodotorula glutinis für 5 Tage bei 25 °C.

3. Woche
In der dritten Woche erfolgte die Ausstrichkontrolle der Ausstrichserie, wobei wiederum auf Homogenität, Vereinzelung und morphologische Charakteristik der Kolonien, sowie Kontamination geachtet wurde.
Im nächsten Schritt wurde von einer bereitgestellten Reinkultur von Pseudomonas fluorescens je eine Schrägagarkultur und eine Kryokultur angefertigt.
Das bereitgestellte Schrägarröhrchen war mit HPG-Agar befüllt (Zusammensetzung s.o.) und das Kryomedium hatte folgende Zusammensetzung:

Kryomedium

• 0,5 ml Nährlösung
• 0,5 ml 85%iges Glycerin
• 3 Glasperlen (aus dem Bastelbedarf)

Das in dem Kryomedium enthaltene Nährmedium hatte folgende Zusammensetzung:

Nährmedium
zu 1000 ml Aqua demin. wurden zugesetzt:

• 5,0 g Fleischpepton
• 3,0 g Fleischextrakt

Der pH-Wert wurde auf 7,0 eingestellt.

Für die Beimpfung des Schrägagars wurde mit der ausgeglühten Impföse von der Agarplatte der Reinkultur reichlich Zellmaterial von einzeln liegenden Kolonien aufgenommen und dann die Impföse in das schräg gehaltene Schrägagarröhrchen (mit der Agarseite nach oben) fast bis zum Boden eingeführt, ohne die Glaswand oder den Agar zu berühren. In etwa 1 cm Entfernung vom Boden des Röhrchens wurde die Impföse auf den Agar aufgesetzt und dann in mäanderförmiger Bewegung auf dem Agar nicht ganz bis zum oberen Ende des Agars ausgestrichen, ohne die Agaroberfläche zu verletzen. Das Schrägagarröhrchen wurde wieder verschlossen, beschriftet und die Impföse ausgeglüht, um etwaiges, verbliebendes Zellmaterial zu vernichten. Das Schrägagarröhrchen wurde für 2 Tage bei 25 °C inkubiert.
Nun erfolgte die Inokulation der Kryokultur. Dazu wurde wiederum mit der ausgeglühten Impföse Zellmaterial von einzeln liegenden Kolonien der Reinkultur aufgenommen, das in der anderen Hand gehaltene ca. 2 cm lange, 2 ml fassende Kryoröhrchen aufgeschraubt und das Inokulum in das Röhrchen eingeführt und gut mit dem Kryomedium verrührt. Anschliessend wurde das Kryoröhrchen verschlossen, die Impföse wieder ausgeglüht und das Kryoröhrchen 5-mal invertiert, um den Inhalt gut zu durchmischen. Dann wurde das Kryoröhrchen erneut aufgeschraubt und mit einer sterilen Pasteurpipette aus Kunstoff das Kryomedium entnommen, so dass nur die Glasperlen im Röhrchen verblieben. Die Pasteurpipette wurde mitsamt dem Inhalt in den Autoklavenmüll überführt, das Kryoröhrchen beschriftet und bei -70 °C eingefroren.

4. Woche
In der vierten Woche wurde die Schrägagarkultur makroskopisch und mikroskopisch auf Homogenität bzw. Reinheit überprüft. Zu diesem Zweck wurde einmal die auf dem Schrägagar gewachsenen Kolonien mit dem blossen Auge untersucht, dann wurde das Röhrchen unter eine UV-Lampe (Licht von 366 nm Wellenlänge) verbracht, um festzustellen ob die Kolonien fluoreszieren und wenn ja, ob die Fluoreszenz gleichmässig auftritt. Ferner wurde mit ausgeglühter Impföse ein Inokulum entnommen und in einem Reagenzglas in einem Tropfen sterilen Wassers suspendiert (Verfahren siehe oben). Von dieser Suspension wurde wiederum mit ausgeglühter Impföse ein Inokulum entnommen und auf einem vorher mit Ethanol gereinigten Objektträger aufgestrichen. Nach dem Trocknen des Aufstrichs wurde der Objektträger bei 400-facher Vergrösserung im Hellfeld mikroskopiert. Nun wurden 4 bereitgestellte, frische KB- und HPG-Agarplatten (je 2) beschriftet und aus der angefertigten Zellsuspension ein Inokulum entnommen und dieses auf dem KB-Agar im 13-Strich-Verfahren (s.o.) ausgestrichen. Ebenso erfolgte eine Beimpfung des HPG-Agars im Dreiösen-Ausstrich-Verfahren (s.o) mit einem Inokulum aus der angefertigten Zellsuspension.
Nun wurde das Kryoröhrchen aufgeschraubt und mit der ausgeglühten Impföse eine der Glasperlen aus dem Röhrchen entnommen, auf den KB-Agar verbracht und dort auf der Agaroberfläche ausgerollt, wobei die Glasperle auf dem Agar verblieb. Mit erneut ausgeglühter Impföse wurde eine weitere Glasperle auf den HPG-Agar verbracht und dort gleichmässig auf der Agaroberfläche ausgerollt. Alle beimpften Agarplatten wurden nun für 2 Tage bei 25° C inkubiert.

5. Woche
In der fünften Woche wurden alle Platten makroskopisch untersucht und auf Reinheit und Homogenität, sowie Kontamination überprüft. Ferner wurden alle Agarplatten unter der UV-Lampe (366 nm) auf Fluoreszenz untersucht. Von dem Ausstrich der Kryokultur auf dem HPG-Agar wurde etwas Zellmaterial suspendiert und ein Inokulum hiervon auf einen gereinigten Objektträger aufgebracht und dieser Ausstrich nach Trocknung bei 400-facher Vergrösserung im Hellfeld mikroskopiert (s. 4. Woche). Die KB-Agarplatte des Ausstrich der Schrägagarkultur, sowie die HPG-Agarplatte der Kryokultur wurde beiseite gestellt und für den Katalasetest in Versuch D2 verwandt.

Ergebnis:

2. Woche
Das Wachstum der einzelnen Mikroorganismen entwickelte sich unterschiedlich: der YGC-Agar war überwiegend mit Rhodotorula glutinis, der KB-Agar überwiegend mit Pseudomonas fluorescens und der HPG-Agar überwiegend mit Bacilus subtilis bewachsen.
Die Ausstrichkontrolle der HPG-, YGC- und KB-Agarplatten im 3-Ösenausstrich und 13-Strich-Verfahren erbrachte die in den folgenden Tabellen dargestellten Ergebnisse:

Tab. 1: Übereinstimmung der Kolonie-
bildung mit dem Ausstrichschema

Agar:	KB	YGC	HPG
+: gute Übereinstimmung -: keine Übereinstimmung ~: tlw. Übereinstimmung
13-Strich-Verfahren:	~	-	+
3-Ösenausstrich:	+	~	+

Tab. 2: Vereinzelung bzw. Isolierung

Agar:	KB	YGC	HPG
+: gute Vereinzelung -: keine Vereinzelung
13-Strich-Verfahren:	+	-	+
3-Ösenausstrich:	+	+	-

Tab. 3: Kontamination

Agar:	KB	YGC	HPG
+: Kontamination -: keine Kontamination Name: Name der Kontaminante
13-Strich-Verfahren:	+	P. fluorescens	+
3-Ösenausstrich:	-	+	-

Die Ergebnisse der Charakterisierung der Koloniemorphologie sind in der folgenden Tabelle dargestellt:

Tab. 4: Kolonienmorphologie

	Farbe	Durchmesser	Form	Rand	Profil	Oberfläche	Konsistenz	Nährbodenverfärbung
YGC: Rhodotorula glutinis	rot	1-2 mm	rund	glatt	konvex	glatt, glänzend	butterig	-
KB: Pseudomonas fluorescens	weiss	1-4 mm	rund	glatt	flach	rauh	gelartig	-
HPG: Bacilus subtilis	weiss	1-2 mm	rund	glatt	konvex	glatt, glänzend	schleimig	-

3. Woche
Die Ausstrichkontrolle des zweiten Verdünnungsausstrichs auf HPG-Agar erbrachte folgendes Ergebnis:

Rhodotorula glutinis: kontaminiert (Kontaminante Rhizobium Sporen), gute Vereinzelung der Kolonien
Pseudomonas fluorescens: kontaminiert (Kontaminante Rhizobium Sporen), keine Vereinzelung der Kolonien
Bacillus subtilis: keine Kontamination, gute Vereinzelung der Kolonien

4. Woche
Die Überprüfung der Reinheit der Schrägagarkultur von Pseudomonas fluorescens ergab folgendes Ergebnis:

Fluoreszenz: gut
Makroskopische Homogenität: gut
Mikroskopische Homogenität: gut

5. Woche
Die Ausstrichkontrolle der Kryokultur und Schrägagarkultur von Pseudomonas fluorescens auf KB- und HPG-Agar ergab folgendes Ergebnis:

KB Schrägagar: fluoreszent, makroskopisch homogen, keine Kontamination
HPG Schrägagar: fluoreszent, makroskopisch homogen, keine Kontamination
KB Kryo: fluoreszent, makroskopisch homogen, kontaminiert mit Rhizobium
HPG Kryo: fluoreszent, makroskopisch und mikroskopisch homogen, keine Kontamination

Ferner war feststellbar, dass die Gelbfärbung der Kolonien auf dem KB-Agar stärker ausfiel, als auf dem HPG-Agar. Auch war das Wachstum auf den Kryokulturplatten stärker, als auf den Schrägagarkulturausstrichen.

Ergebnisdiskussion:

Insgesamt war die Isolierung und Gewinnung einer Reinkultur, sowie die Verdünnungsausstriche befriedigend verlaufen. Dass zahlreiche Ansätze mit Rhizobium kontaminiert waren, zeigt, dass selbst bei Einhaltung der Richtlinien für steriles Arbeiten, eine Kontamination mit Fremdkeimen erfolgen kann, insbesondere dann, wenn die Konzentration der Kontaminante erhöht ist. Deshalb empfiehlt es sich, solche Arbeiten immer unter der Sterilbank durchzuführen, um die Kontaminationsgefahr zu minimieren. Auch ist anzumerken, dass man normalerweise das Ausstrichverfahren mehrfach wiederholt, um zu gewährleisten, dass keine Kontaminanten mehr in der Reinkultur anzutreffen sind.
In Abweichung von der Versuchsvorschrift wurden, aufgrund von Zeitmangel, nicht in allen Zwischenschritten Präparate angefertigt, die normalerweise zur Überprüfung der Homogenität mikroskopiert werden. Dies würde man sicherlich bei der Gewinnung einer neuen Reinkultur anders handhaben.
Der Effekt aus der Auswertung der Ausstriche der Schrägagar- bzw. Kryokulturen, dass die Gelbfärbung stärker auf den KB-Agarplatten auftrat, ist darauf zurückzuführen, dass der King-B Agar ein Differentialmedium ist, welches aufgrund seiner Eisenarmut die Bildung von Siderophoren, z.B. Pyoverdine (Pseudobactine) bei Pseudomonas verstärkt. Diese Farbstoffe dienen Pseudomonas dazu, Eisen aus dem Medium in die Zelle aufzunehmen (über sogenannte funktionelle Hydroxamat-Gruppen).
Nachzutragen bleibt noch die Berechnung der molaren Massen bzw. molaren Konzentrationen des King-B-Agars:
Die Angabe für die Zusammensetzung des King-B-Agars war auf 1000 ml Wasser (in, d.h. in 1000 ml Wasser gelöst) bezogen und in Masseeinheiten g angegeben, so dass die molaren Konzentrationen fü die entsprechenden Substanzen berechnet werden mussten.

Rechnung:
Für Glycerin (C₃H₈O₃) war eine Masse von 10 g angegeben.
Die molare Masse von C₃H₈O₃ ergibt sich zu:
(12u * 3) + (16u * 3) + (1u * 8) = 92u entspricht 92 g/mol
Die Masse von 10 g pro 1 l ergibt also eine molare Konzentration von:
10 g / 92 g/mol = 0,1086 mol/Liter

Für Tri-Kaliumphosphat-3-hydrat (K₃PO₄ x 3 H₂O) war eine Masse von 1,8 g pro 1000 ml angegeben.
Die molare Masse von K₃PO₄ x 3 H₂O ergibt sich zu:
(39u * 3) + (31u * 1) + (16u * 4) + (6u * 1) + (16u * 3) = 266u entspricht 266 g/mol
Die Masse von 1,8 g pro l entspricht also einer molaren Konzentration von:
1,8 g / 266 g/mol = 0,0677 mol/Liter

Für Magnesiumsulfat MgSO₄ war eine Masse von 1,5 g pro 1000 ml angegeben.
Die molare Masse von MgSO₄ ergibt sich zu:
(24,3u * 1) + (32u * 1) + (16u * 4) = 120,3u entspricht 120,3 g/mol
Die Masse von 1,5 g pro l entspricht also einer molaren Konzentration von:
1,5 g / 120,3 g/mol = 0,0125 mol/Liter

Versuchsziel:

In diesem Versuch soll die Katalase-Aktivität verschiedener Bakterienkulturen (Pseudomonas fluorescens und Milchsäurebakterien) überprüft werden.

Theoretische Grundlagen:

Sauerstoff in seiner molekularen Form als O₂ Molekül wirkt auf alle lebenden Zellsysteme aufgrund seiner Oxidationswirkung toxisch und wird auch als Zellgift bezeichnet. In noch stärkerem Ausmass gilt dies für anaerobe Organismen, da diese Sauerstoff nicht als terminalen Elektronenakzeptor der Atmungskette verwenden und ihn somit nicht in Form von Wasser (H₂O) unschädlich machen können. Die Aktivierung des Sauerstoffs kann 3 unterschiedliche Formen annehmen, die alle von sogenannten Oxidasen katalysiert werden und bei denen folgende Intermediate (Zwischenprodukte) enstehen:

O₂ + 4 e^- -> O^2- + O^2- Oxid-Ionen
O₂ + 2 e^- -> O₂^2- Peroxid-Ion
O₂ + 1 e^- -> O₂^- Superoxid-Ion

Für diese Sauerstoff-Ionen gilt in noch stärkerem Masse, was für molekularen Sauerstoff festgestellt wurde: Sie sind sehr reaktive Reaktanden, die die Zelle und ihre Bestandteile nachhaltig schädigen können. Daher haben die meisten Organismen Enzymsysteme, die die bei der Reduktion von Sauerstoff entstehenden Intermediate unschädlich machen. Oxid-Ionen reagieren mit Protonen zu dem für die Zelle harmlosen Wasser, Peroxid-Ionen reagieren mit H⁺-Protonen zu Wasserstoffperoxid (H₂O₂), welches ebenfalls sehr reaktiv und für die Zelle schädlich ist. Das Superoxid-Ion reagiert mit Wasserstoffperoxid und Wasserstoffprotonen weiter zu molekularem Sauerstoff, Wasser und dem Hydroxyl-Radikal, welches wiederum für die Zelle toxisch ist. Die Folgereaktionen der Sauerstoffaktivierung sind nachfolgend noch einmal aufgeführt:

O^2- + 2 H⁺ -> H₂O
O₂^2- + 2 H⁺ -> H₂O₂
O₂^- + H₂O₂ + H⁺ -> O₂ + H₂O + OH^.

Um das entstehende Wasserstoffperoxid unschädlich zu machen, besitzen die meisten aeroben Organismen das Enzym Katalase, welches H₂O₂ zu Wasser und molekularem Sauerstoff zersetzt:

2 H₂O₂ -> 2 H₂O + O₂

Ferner existieren noch Peroxidasen, die in der Lage sind Wasserstoffperoxid durch Protonierung zu entgiften:

NADH₂ + H₂O₂ -> NAD⁺ + 2 H₂O

Um die Entstehung von Hydroxyl-Radikalen zu vermeiden, besitzen aerobe und aerotolerante Organismen das Enzym Superoxid-Dismutase, welches das Superoxid-Ion aus der Aktivierung des Sauerstoffs in das etwas unschädlichere Wasserstoffperoxid und molekularem Sauerstoff umwandelt:

2 O₂^- + 2 H⁺ -> H₂O₂ + O₂

Anaerobe Organismen verfügen i.d.R. nicht über diese Enzymsysteme.
Die Katalasereaktion macht man sich bei der Charakterisierung von Mikroorganismen zunutze, indem man bei Organismen, die dieses Enzym besitzen, die Gasentwicklung des molekularen Sauerstoffs beobachten kann. Anhand dieser Reaktion können also aerobe von aneroben und meist auch von aerotoleranten Organismen unterschieden werden. ^[2]

Versuchsdurchführung:

In diesem Versuch wurden die beiseite gelegten Agarplatten der Ausstriche von Pseudomonas fluorescens aus Versuch D1 (ein KB-Agar aus der Schrägagarkultur und eine HPG-Agarplatte aus der Kryokultur), sowie die Agarplatten der Ausstriche der Milchsäurebakterien aus Versuch H (ein M17-Agar mit Streptococcus und ein Rogosa-Agar mit Lactobacillus) einem Katalase-Test unterzogen. Zu diesem Zweck wurde die erste der Agarplatten gerade auf den Labortisch gestellt, der Deckel der Petrischale abgenommen und mit bereitstehender 3 %-iger Wasserstoffperoxidlösung (H₂O₂) aus einem kleinen Erlenmeyerkolben so übergossen, dass der Agar gleichmässig von der Flüssigkeit bedeckt wurde. Nun wurde kurz abgewartet, ob es zu einer Gasentwicklung in der Flüssigkeit über dem Agar kam und das Ergebnis notiert. Nach der gleichen Vorgehensweise wurden alle Agarplatten getestet. Die getesteten Agarplatten wurden in den Autoklavenmüll überführt.

Ergebnis:

Sowohl der Katalase-Test mit dem KB-Agar der Schrägagarkultur, als auch dem HPG-Agar der Kryokultur verlief positiv, d.h. es war optisch eine starke Gasentwicklung feststellbar, die durch heftiges Aufschäumen und Blasenbildung der Flüssigkeit gekennzeichnet war. Bei beiden Agarplatten (M17-Agar mit Streptococcus und der Rogosa-Agar mit Lactobacillus) des Versuches H war keinerlei Gasentwicklung feststellbar.

Ergebnisdiskussion:

Als Ergebnis dieses Versuches lässt sich festhalten, dass Pseudomonas fluorescens Katalase-positiv ist und somit über das Schutzenzym Katalase verfügt, während die Milchsäurebakterien Streptococcus und Lactobacillus Katalase-negativ sind und nicht über das Enzym Katalase verfügen. Somit lässt sich Pseudomonas fluorescens als aerober Organismus und die Milchsäurebakterien als zumindest aerotolerante oder gar anaerobe Organismen klassifizieren.
Anzumerken ist noch, dass man das entstehende Gas auch auffangen und weiteren Untersuchungen unterziehen könnte, um zu verifizieren, dass es sich tatsächlich um Sauerstoff (O₂) handelt.

Referenzen:

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